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運(yùn)用超高效液相色譜-生物化學(xué)檢測在線聯(lián)用分析方法篩選中藥中的丁酰膽堿酯酶抑制劑(二)

發(fā)布時間:2021-06-14 18:42 編輯者:特邀作者夏德婷

2.3 UPLC-DAD-BChE在線分析方法

2.3.1 UPLC色譜條件

色譜柱Xtimate UPLC C18色譜柱(2.1 mm ×100 mm,1.8 μm);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:2 μL;流速:0.08 mL·min-1;流動相:甲醇(B)-0. 1%甲酸水溶液(A)。

吳茱萸色譜條件:檢測波長330 nm;梯度洗脫:0~5 min,10%B;5~50 min,10%~45%B;50~70 min,45%~95%B;70~85 min,95%B。

鉤藤色譜條件:檢測波長 245 nm;梯度洗脫:0~10 min,10%~30%B;30~70 min,30%~45%B;70~90 min,45%~95%B;90~100 min,95%B。

苦參和山豆根色譜條件:檢測波長225 nm;梯度洗脫:0~5 min,5%B;10~40 min,5%~50%B;40~80 min,50%~95%B;80~90 min,95%B。

蓮心堿色譜條件:檢測波長:290 nm;流動相:甲醇(B)-0.1%甲酸溶液(A)(20:80)。

UPLC流速:0.08 mL·min-1;柱后BChE、DTNB混合溶液和BTCI流速分別為0.30 mL·min-1和0.10 mL·min-1。

2.3.2 UPLC-DAD-BCD在線聯(lián)用儀器系統(tǒng)

UPLC-DAD-BCD聯(lián)用儀器裝置見圖1。溶液流路采用三通管和相同內(nèi)徑的PEEK管連接。柱后衍生儀泵一為酶和DTNB混合溶液,泵二BTCI溶液。提取物經(jīng)過UPLC色譜柱分離后,在PDA檢測器顯示指紋圖譜,再與柱后衍生儀中的溶液反應(yīng),經(jīng) DAD檢測器檢測得到活性圖譜,酶+DTNB、BTCI溶液流速分別為0.30和0.10 mL·min-1,反應(yīng)管0.5 mL,在405 nm檢測酶抑制活性圖譜。其反應(yīng)原理如下:當(dāng)柱后衍生儀以恒定的流速運(yùn)輸BChE與DTNB混合溶液和BTCI溶液,3種溶液在反應(yīng)管中連續(xù)反應(yīng),生成的5-thio-2-nitrobenzoate為黃色產(chǎn)物,可在405 nm處檢測得到平穩(wěn)基線。當(dāng)UPLC分離出活性物質(zhì)進(jìn)入BChE反應(yīng)體系,黃色產(chǎn)物量降低,同時在DAD檢測器上面就會呈現(xiàn)倒峰,從而實(shí)現(xiàn)BChE抑制劑的在線檢測。

2.4 UHPLC-LTQ/Orbitrap MS方法

UHPLC分析條件同“2.4.1”,流速為0.2 mL·min-1。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)正離子模式;鞘氣(N2)和輔助氣(Ar)流速分別為40和10 arb. unit;毛細(xì)管溫度320 ℃;離子源電壓3.5 kV,電流100 μA;一級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍為100~1 000 m/z,分辨率為60 000;二級質(zhì)譜采用HCD模式,依賴一級質(zhì)譜掃描中的1th到5th強(qiáng)峰,分辨率15 000;HCD裂解能量35 V。

3 結(jié)果與討論

3.1 UPLC-DAD-BChE在線分析方法的考察

流動相中的甲醇和乙腈能降低酶的活性,采用HPLC建立在線檢測方法需通過柱后分流降低流動相在酶反應(yīng)體系的比例,減少對酶活性的影響,此在線聯(lián)用方式會產(chǎn)生儀器的兼容性等問題,導(dǎo)致在線檢測方法穩(wěn)定性較差。本研究采用UPLC使流速為0.08 mL·min-1,不分流即可滿足在線檢測的要求。

蓮子心被報(bào)道具有BChE抑制作用,按照“2.3.2”項(xiàng)下的方法,運(yùn)用UPLC-DAD-BCD對蓮心堿抑制活性進(jìn)行分析,見圖2。圖2為五個不同濃度蓮心堿的UPLC圖譜和BChE抑制峰(60,120,600,1 200和 1800 μg·mL-1),以活性指紋圖譜的倒峰面積為橫坐標(biāo)(X),蓮心堿濃度為縱坐標(biāo)(Y),得到蓮心堿的量效曲線方程Y= 351.56X3-1 098.8X2+ 1 473X-32.205 (R² = 0.999 7),表明UPLC-DAD-BCD方法能夠用于酶抑制劑的篩選和活性評價。由圖二上和下對應(yīng)峰的保留時間可得在線檢測的延遲時間為2 min左右。

聲明:本文所用圖片、文字來源《中國醫(yī)院藥學(xué)雜志》,版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,請與本網(wǎng)聯(lián)系刪除。

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