中國是世界上最大的抗生素生產和使用國．據(jù)估計，我國抗生素年使用量超過1.6×105t，然而藥用抗生素只有少部分可以被機體吸收利用，大部分會以藥物原形或代謝產物的形式進入環(huán)境．抗生素一旦進入環(huán)境，可能通過食物鏈進行傳遞，進而對人類和動物健康以及生態(tài)環(huán)境造成極大的威脅．另一方面，在低濃度長期暴露下，抗生素還會誘導產生抗性基因．因此，了解抗生素在環(huán)境中的賦存水平，可以為相關環(huán)境部門評估抗生素生態(tài)風險與管理抗生素的使用提供強有力的數(shù)據(jù)支撐．

氟喹諾酮類抗生素(FQs)是在喹諾酮類抗生素主環(huán)的6位或8位加上1個F原子衍生而來，因其具有廣譜性、抗菌性強等優(yōu)點而被廣泛應用，導致其在環(huán)境中有較高的檢出率和檢出濃度．目前，環(huán)境樣品中FQs的定量方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫分析法等．但是在復雜的基質干擾下，對目標污染物的準確檢測要求儀器有較高的選擇性和靈敏度，電噴霧離子源高分辨飛行時間質譜可提供目標物母離子和碎片離子的精確質量數(shù)，不僅提高了目標物定性篩查的可靠性，也可獲得較高靈敏度的定量數(shù)據(jù)．

本文利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UPLC-QTOF)在電噴霧正離子條件的3種模式:MS (Mass Scan)、MSE、MRM (Multiple Reaction Monitoring)，建立同時測定5種FQs的定量分析方法，并與超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜(UPLC-TQMS)的方法進行比較研究．

1實驗部分

1.1儀器與試劑

超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)時間飛行質譜儀(UPLC-QTOF，美國Waters)，配有電噴霧離子源；超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀(UPLC-TQMS，美國Waters)，配有電噴霧離子源；PURELAB flex純水儀(英國ELGA)；玻璃纖維濾膜(GF/F,0.7μm，英國Whatman)；Oasis親水親油平衡(Hydrophilic Lipophilic Balance,HLB)固相萃取柱(500 mg,6 m L，美國Waters)；甲醇、乙腈(HPLC級，德國Merck)；HPLC級甲酸(HPLC級，阿拉丁)；本實驗用水均為超純水(18.2 MΩ·cm).

標準品:環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CFX)、恩諾沙星(Enrofloxacin,EFX)、諾氟沙星(Norfloxacin,NFX)、氧氟沙星(Ofloxacin,OFX)、培氟沙星(Pefloxacin,PFX)和內標環(huán)丙沙星-D₈(CiprofloxacinD₈,CFX-D₈)均購于德國Dr.Ehrenstorfer Gmb H．所有標準品純度均不低于98%(質量分數(shù))．

標準溶液的配制:準確稱取適量各標準品，并用甲醇溶解配制成質量濃度為100 mg/L的單一標準儲備液，放入-20℃低溫的冰箱中避光保存．

1.2質譜方法的建立

1.2.1 UPLC-QTOF方法

將質量濃度為100μg/L的各化合物單標分別在UPLC-QTOF上進行一級質譜全掃描，分析得到母離子，并在高能量通道掃描其二級質譜．隨后，在MRM模式下優(yōu)化5種FQs的特征離子對、毛細管電壓、碰撞能等質譜參數(shù)，選取響應強、干擾小的離子作為定量和定性離子．

1.2.2 UPLC-TQMS方法

將各FQs的單標標準品在全掃描模式下直接進樣，并利用Mass Lynx4.1軟件中質譜參數(shù)優(yōu)化的功能，確定各目標化合物的最優(yōu)碰撞能、錐孔電壓等參數(shù)．

1.3色譜方法的建立

色譜柱選用Waters ACUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7μm)．在低p H條件下可保持FQs在流動相中穩(wěn)定的溶解狀態(tài)，采用甲酸來控制流動相的p H，比較甲醇和乙腈作有機相時，目標物色譜峰的峰形、響應強度以及分離度．此外，本文考察了0.1%(體積分數(shù)，全文同)甲酸水-甲醇、0.2%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相時對目標物峰形和響應值的影響．隨后，調節(jié)流動相初始體積比和洗脫梯度，確定最佳液相測試方法．

柱溫不僅會影響目標化合物的保留時間，也會影響目標物的分離和響應．比較不同柱溫(30、40、50℃)對目標化合物響應強度的影響．

在UPLC-TQMS上直接應用UPLC-QTOF確定的色譜柱、流動相及液相洗脫方法，并適當優(yōu)化洗脫梯度，以使目標化合物的響應和峰形更好．

1.4方法性能的比較

1.4.1線性關系

將標準儲備液逐級稀釋，配制成質量濃度為0.5、1、5、10、20、50、100μg/L的混合標準溶液，按照優(yōu)化后的色譜-質譜條件測定，使用內標法定量．以目標物定量離子與內標定量離子的峰面積之比為縱坐標，標準溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線．

1.4.2定量限、檢出限及數(shù)據(jù)存儲大小比較

為測定儀器檢出限和定量限，將低濃度的混標工作液(7個平行樣)在2臺儀器的各個模式下分別連續(xù)測定，同時準備7組甲醇溶液，按以上步驟測定．通過幾次測定結果的標準偏差，計算儀器檢出限和定量限．此外，比較UPLC-QTOF的3種質譜采集模式下和UPLC-TQMS的MRM模式下，測定1個樣品所需的數(shù)據(jù)存儲空間．

1.4.3儀器的精密度

對低、中、高質量濃度的FQs混標工作液重復測定6次，根據(jù)6次重復測定數(shù)據(jù)的相對標準偏差來考察儀器的精密度．

1.5方法應用

于廣東省茅洲河上游和中游分別采集3個1 L水樣，加入0.4 m L 4 mol/L硫酸以調節(jié)p H，加入50m L甲醇抑制微生物的生長．上游和中游樣品分別命名為樣品1、2．將水樣置于含有冰袋的采樣箱，迅速運回實驗室．參照文獻的方法，將1 L水樣過玻璃纖維濾膜，加入100μL 1 mg/L CFX-D₈內標，混勻后采用固相萃取法提取水樣中抗生素．依次用10 m L甲醇和10 m L超純水活化HLB萃取柱，將過濾后的水樣以5～10 m L/min的流速加載于固相萃取柱，樣品瓶用50 m L 5%甲醇水潤洗2次．用10 m L超純水清洗小柱，對萃取柱真空抽干2 h，用10 m L甲醇進行洗脫，收集洗脫液，用氮氣吹干，用1m L初始流動相復溶，采用孔徑為0.22μm的濾膜過濾，將濾液分別在2臺儀器各模式下進行檢測．

2結果與討論

2.1質譜條件的優(yōu)化

2.1.1 UPLC-QTOF質譜條件

優(yōu)化的質譜條件:電噴霧離子源，正離子模式；毛細管電壓為2.0 k V，錐孔電壓為40 V，離子源溫度為120℃；脫溶劑氣溫度為500℃，脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔氣流速為50 L/h；掃描模式MS/MSE/MRM，質荷比m/z范圍為50～1 200；Lockmass為亮氨酸腦啡肽(2μg/L)溶液；采集時間0.5 s，采集間隔時間10 s，掃描精確質荷比為556.277.5種FQs在該儀器上的質譜采集參數(shù)見表1.UPLC-QTOF所采集目標物的相對分子質量偏差均小于±0.3 m Da，表明該儀器可提供較精確的質荷比，可為復雜環(huán)境基質樣品的準確定量分析提供條件．

2.1.2 UPLC-TQMS的質譜條件

采用電噴霧離子源、正離子模式；毛細管電壓為2.0 k V，錐孔電壓為40 V；離子源溫度為120℃，脫溶劑氣溫度為300℃；脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔氣流流速為150 L/h；掃描模式為MRM.FQs結構中含有羧基和氨基，當溶液為酸性時，其呈現(xiàn)陽離子狀態(tài)，并在ESI+模式下，易形成[M+H]+準分子離子，可作為母離子．5種FQs及其內標在該儀器上的質譜采集參數(shù)見表2.

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